Mieszkańcy Łukowa już od chwili odzyskania niepodległości marzyli o utworzeniu muzeum, gdzie mogliby gromadzić lokalne pamiątki historyczne i wytwory kultury ludowej. Miało się ono mieścić w opuszczonym budynku cerkwi, nie użytkowanej od czasu wyjazdu z miasta Rosjan. Projekt ten nie został zrealizowany z powodu zbyt wysokich kosztów adaptacji cerkwi na potrzeby muzealne.
Kolejną próbę podjęto w połowie lat ‘20. W majowym numerze „Gazety Łukowskiej” z 1925 r. regionalista Jan Stanisław Majewski apelował: „Muzeum Ziemi Łukowskiej, gdzie by można zgromadzić całe nasze lokalne bogactwo, powinniśmy jak najprędzej stworzyć, bo z każdym rokiem tracimy nieocenione i bezpowrotne skarby. Tu i ówdzie są jeszcze w posiadaniu drobnej szlachty lub w aktach różnorodnych urzędów stare pergaminy – nadania królewskie; w kościołach wiejskich przechowuje się różne staroświeckie, prymitywne statuetki świętych (…); tam i siam znajdzie się jakąś starą monetę, lecz wszystko to nadzwyczaj szybko ginie; (…) narzędzia rolnicze, jak socha, również zanikają gwałtownie i jutro może już być za późno chcieć to odtworzyć w rysunkach i fotografii. I rychło, a możemy ostać bez pamiątek i dowodów naszego ubiegłego życia, bez tradycji”. Ten słuszny apel pozostał bez echa, ustępując przed bardziej pilnymi inwestycjami.
Po raz trzeci pomysł odżył po wojnie, tym razem z pozytywnym skutkiem. Staraniem Towarzystwa Przyjaciół Ziemi Łukowskiej, uchwałą nr 225/1959 władze powiatu powołały do istnienia Muzeum Ziemi Łukowskiej, przeznaczając na ten cel 100 tysięcy zł. Muzeum zaczęło funkcjonować z dniem 1 stycznia 1960 r. Wśród inicjatorów jego powstania byli zasłużeni obywatele miasta, m. in.: dr Ryszard Kaszubski, Janina Tryboń, dr Leon i Maria Kierniccy. Na kierownika placówki wyznaczono Longina Kowalczyka. Warto zaznaczyć, że nazwa Muzeum Ziemi Łukowskiej nie przyjęła się i placówka od początku funkcjonowała jako Muzeum Regionalne w Łukowie.
Siedzibą muzeum miało być początkowo piętro budynku dawnego kolegium pijarskiego, zajmowane ówcześnie przez szpital, które zamierzano wyremontować do 1961 r. Rozpatrywano też drugą możliwość – budynek Konwiktu Szaniawskich, lecz ta propozycja została na wstępie odrzucona ze względu na zbyt małe i ciemne pomieszczenia, nie nadające się do celów ekspozycyjnych, a także na zbyt długi czas oczekiwania: w budynku tym mieścił się Sąd Powiatowy, którego przeniesienie planowano dopiero na 1963 r.
Tymczasem, nie zważając na przejściowe trudności lokalowe, trwało poszukiwanie i pozyskiwanie zbiorów. „Muzeum Okręgowe w Lublinie zapewniało transport i ekipę etnografów do prowadzenia badań etnograficznych na terenie powiatu łukowskiego – wspominał Kowalczyk. – Jeździliśmy od wsi do wsi i w ten sposób gromadziliśmy eksponaty”. Dokumentowano też obrzędy ludowe i architekturę drewnianą podłukowskich wsi. „Wyjeżdżało się na wieś, ludzie schodzili się w jednym domu wieczorem i śpiewali. Na początku były trudności. Ludzie byli nieufni, nie chcieli nas wpuszczać do domów. Kiedyś, gdy uznano mnie i moją ekipę za poborców podatkowych, baba miotłą chciała nas wytłuc” – wspominał kierownik. Mimo to w latach 1960-1961 przebadano 80 miejscowości, z których pozyskano 669 eksponatów. Wśród nich najciekawsze były drewniana socha oraz spódnica z II połowy XIX w. Pierwsza wystawa została zorganizowana w sierpniu 1961 r., a gościny użyczył jej Powiatowy Dom Kultury w Łukowie. Obejrzało ją prawie 2000 osób.
Wszystkie zabytki były początkowo przechowywane w domu prywatnym kierownika muzeum, który wkrótce stał się zbyt mały, aby je pomieścić: „zajmowaliśmy z żoną trzy pokoje, w jednym mieszkaliśmy, a w dwóch przechowywałem eksponaty”. Obiecany lokal po przeniesionym szpitalu został zajęty przez liceum pielęgniarskie i ostatecznie siedzibą muzeum stała się drewniana oficyna w podwórzu dawnego Konwiktu Szaniawskich. Po zawaleniu się w niej belki stropowej zbiory zostały przeniesione do bloku lekarskiego przy ul. Partyzantów, a później (w 1963 r.) do starego, walącego się budynku przy ul. Świerczewskiego. Przeciekający dach i panująca tam wilgoć oczywiście nie miały dobrego wpływu na przechowywane eksponaty.
W 1963 r. ogłoszono konkurs pt. „Sztuka ludowa powiatu łukowskiego”, na który wpłynęło 157 prac, z czego 46 komisja uznała za wybitne osiągnięcia sztuki ludowej. Najciekawsze prace wyeksponowano na drugiej łukowskiej wystawie muzealnej. Przez trzy tygodnie obejrzało ją 3000 zwiedzających.
Dopiero w 1964 r. oddano na potrzeby muzeum połowę parteru Konwiktu Szaniawskich. Prace remontowe i adaptacyjne trwały tam do stycznia 1967 r. Oficjalne otwarcie muzeum oraz dwóch wystaw nastąpiło 7 marca 1967 r. Były to ekspozycje: „Tkactwo północnej Lubelszczyzny” i „Walki wyzwoleńcze na terenie Ziemi Łukowskiej”. Muzeum liczyło wtedy dwóch pracowników – obok kierownika był jeszcze fotograf Karol Cieślak. „Przygotowanie pierwszych wystaw nie było łatwe – wspomina Kowalczyk. – Podpisy, plakaty i oprawę plastyczną trzeba było robić ręcznie. Do tego zatrudnialiśmy znanych plastyków”.
Dopiero w 1976 r., po przeniesieniu Powiatowego Archiwum Państwowego, muzeum uzyskało do swojej dyspozycji cały budynek Konwiktu. Był on w bardzo złym stanie technicznym i wymagał generalnego remontu. Przeprowadzono go w latach 1985 – 1998; prace przedłużały się głównie z powodu przeszkód finansowych. W tym czasie eksponaty krążyły między różnymi pomieszczeniami magazynowymi, zmieniając miejsce przechowywania aż 17 razy. Tymczasową siedzibą muzeum stał się budynek obecnej apteki przy ul. ks. S. Brzóski. Wystawy urządzano gościnnie w muzeach w Białej Podlaskiej i Siedlcach, a także w lokalnych ośrodkach kultury. Wznowienie działalności po remoncie zainaugurowano wystawą pt. „Twórcy Ludowi Łukowskiego Ośrodka Rzeźby Ludowej”, otwartą w budynku Konwiktu w listopadzie 1998 r.
Longin Kowalczyk pełnił funkcję kierownika, a potem dyrektora muzeum przez blisko 50 lat. Po jego przejściu na emeryturę muzeum kierowali kolejno: Grzegorz Osial i obecnie Mariusz Burdach.
Obecnie muzeum dysponuje ośmioma salami wystawowymi, pracownią fotograficzną, pomieszczeniami magazynowymi oraz administracyjnymi. Do dwóch stałych wystaw – geologicznej („Łukowskie amonity”) i etnograficznej („W polu i w zagrodzie”) – w 2017 r. dołączyły dwie wystawy historyczne: „Historia Łukowa i Ziemi Łukowskiej” oraz „Tu mieszkaliśmy – historia łukowskich Żydów”. Od 2015 r. posiadamy też stały kącik poświęcony łukowskiemu pszczelarstwu, przypominający postać Kazimierza Lewickiego, i małą galerię rzeźby ludowej. W korytarzu eksponujemy artystyczne fotografie przyrody rezerwatu „Jata”, wykonane na płótnie. Wszystkie te wystawy tworzą wspólnie pełny obraz kulturalno-historyczno-przyrodniczy Ziemi Łukowskiej. Sala kominkowa przeznaczona została na wystawy czasowe, zmieniane co kilka tygodni, wypożyczane z innych muzeów lub przygotowywane przez naszych pracowników.
Od początku swego istnienia do 2020 r. muzeum zorganizowało ogółem 505 wystaw, z których w ciągu ostatnich 10 lat największą popularnością cieszyły się: wystawa o Helenie Mniszek (2010), „Polskie stroje ludowe” (2012), „…Miałem kiedyś narzeczoną z Łukowa. Wystawa malarstwa Edwarda Dwurnika” (2012), „Kolorowy świat zabawek” (2012), „Ikony – niebiański świat” (2013), „Dawnych wspomnień czar. 90-lecie Klubu Sportowego Orlęta Łuków” (2013), „Łukowianie Janowi Pawłowi II” (2014), „50-lecie Łukowskiego Ośrodka Rzeźby Ludowej” (2015), „Huta Dąbrowa kolebką przemysłu szklarskiego w powiecie łukowskim” (2016), „Bogurodzica, Królowa, Matka. Różne twarze Marii” (2016), „Stoi na stacji lokomotywa… 150 lat Kolei Warszawsko-Terespolskiej” (2016), „Templariusze znowu w Łukowie” (2018), „Kobieta w sztuce” (2018), „100 lat Gimnazjum i Liceum im. T. Kościuszki w Łukowie” (2018), „Bursztyn bałtycki i żywice świata” (2019), „Ach, co to był za ślub…” (2019).
Prócz wystaw, organizujemy również plenery rzeźbiarskie, warsztaty twórczości ludowej dla dzieci i młodzieży, konkursy plastyczne, fotograficzne i literackie, konferencje naukowe z udziałem zaproszonych prelegentów, lekcje muzealne, a także koncerty, gry miejskie i inne atrakcje, związane z międzynarodową Nocą Muzeów. Na co dzień udzielamy konsultacji merytorycznych i udostępniamy do badań dokumenty historyczne oraz nasz księgozbiór naukowy, liczący ponad 2000 pozycji. Prowadzimy badania naukowe nad historią naszego regionu, publikując ich wyniki w wydawnictwach książkowych. Wraz z Towarzystwem Przyjaciół Ziemi Łukowskiej redagujemy kolejne numery „Zeszytów Łukowskich”. Współpracujemy przy produkcji filmów o tematyce historycznej, promujących nasz region. Upamiętniamy też miejsca historyczne: w 1985 r. staraniem muzeum wmurowano tablicę POW na ścianie starostwa (usuniętą przez Niemców i odnalezioną po wojnie w Lublinie), w 2012 r. na budynku PKO/PZU umieszczono tablicę poświęconą martyrologii Żydów łukowskich, w 2015 r. postawiono obelisk w miejscu dawnej synagogi łukowskiej, a w 2018 r. odsłonięto pomniki poświęcone powstańcom styczniowym w Łazach i Brzozowicy.
Muzeum Regionalne w Łukowie przyczyniło się po powstania kolejnych jednostek kultury: w 1965 r. pod jego auspicjami powstał Łukowski Ośrodek Rzeźby Ludowej, w 1966 r. Muzeum Henryka Sienkiewicza w Woli Okrzejskiej (do 1975 r. oddział łukowskiego muzeum), w 1967 r. Izba Pamięci Narodowej w Woli Gułowskiej (początkowo w szkole podstawowej, w 1989 r. przeniesiona do Domu Kultury – Pomnika Czynu Bojowego Kleeberczyków, od 2014 r. Muzeum Czynu Bojowego Kleeberczyków). Od początku swego istnienia muzeum objęło też opieką twórców ludowych z powiatu łukowskiego, działających w Stowarzyszeniu Twórców Ludowych (od 1975 r. STL Oddział Siedlce, od 2003 r. STL Oddział Łuków).